一、技術(shù)原理與核心突破

CRISPR/Cas9系統(tǒng)源于細(xì)菌適應(yīng)性免疫機(jī)制，通過(guò)雙RNA引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶向DNA切割：

1. 引導(dǎo)機(jī)制：

• crRNA（CRISPR RNA）識(shí)別靶序列，tracrRNA（反式激活crRNA）激活Cas9酶，兩者可融合為sgRNA（單鏈引導(dǎo)RNA）。

• PAM序列（5'-NGG-3'）是Cas9切割的必要位點(diǎn)，位于靶基因下游。

2. 切割模式：

• Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈，形成雙鏈斷裂（DSB）。

3. 修復(fù)路徑：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：易產(chǎn)生插入/缺失突變（Indels），導(dǎo)致基因敲除。

• 同源定向修復(fù)（HDR） ：需提供同源修復(fù)模板（ssODN或載體），實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)插入或點(diǎn)突變。

革命性突破：CRISPR/Cas9shou次實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效、可編程基因編輯，且支持多靶點(diǎn)同步編輯。

二、動(dòng)物模型構(gòu)建策略與技術(shù)優(yōu)化

（一）核心操作流程

（二）關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)

（三）模型類型與構(gòu)建效率

三、疾病模型應(yīng)用與前沿案例

（一）腫瘤模型

1. 肝癌：

• 同步靶向肝細(xì)胞抑癌基因 PTEN 和 P53，8周內(nèi)誘發(fā)肝癌。

2. 腦瘤：

• 多基因編輯（Ptch1/Trp53/Pten/Nf1）構(gòu)建成神經(jīng)管細(xì)胞瘤模型。

3. 肺癌：

• 組織特異性模型：條件性Cas9小鼠 + AAV9遞送sgRNA（靶向Kras/p53/Lkb1），實(shí)現(xiàn)肺組織特異性致癌。

（二）遺傳病模型

（三）神經(jīng)與代謝疾病

• 阿爾茨海默病：

• MAPT突變模型：CRISPR/Cas9編輯小鼠tau蛋白基因，模擬神經(jīng)纖維纏結(jié)。

• 糖尿病：

• db/db小鼠改良：CRISPR精準(zhǔn)引入Lepr突變，縮短模型構(gòu)建周期至12周。